布景

因为其经久性和高信息密度，DNA已成为归档数据存储的一种有吸引力的介质。可扩大的并行随机拜候是任何存储系统所但愿具有的抱负特征。但是，对基在DNA的存储系统，这仍需要获得稳健简直认。比来，Bas等[1]人报导了一种热限制PCR手艺，它可以或许实现隔离的DNA文件的多路复用、反复的随机拜候。该策略基在将生物素功能化寡核苷酸定位在热响应的半透性微胶囊内。在低温下，微胶囊对酶、引物和扩增产品是可渗入的，而在高温下，膜的坍塌避免了扩增时代份子间的干扰。该研究成果注解，与反复的随机拜候比拟，该平台优在非隔离的DNA存储，而且在多路PCR反映时代削减扩增误差十倍。利用荧光分选，作者还演示了经由过程微胶囊条形码进行样品聚集和数据检索。是以，热响应微胶囊手艺供给了一种可扩大的、序列无关的方式，用在反复的随机拜候归档DNA文件。

尝试成果

作者设计的热限制PCR方式操纵具有温度依靠性膜渗入性的微反映器来加强PCR扩增的正确性。利用这类策略，作者从复杂的DNA池实现多个DNA文件的多重，反复的PCR拜候。作者的方式基在将生物素化的DNA文件不变地封装在热响应的半透性微胶囊的个别群体内（图1a），然后对这些群体进行聚集。膜的怪异热响应性渗入性极年夜地削减了PCR温度下的份子干扰和陪伴的假象构成，从而答应多个数据编码的DNA文件被忠厚地扩增。与乳化PCR比拟，非生物素化的扩增产品可以在室温下从原始的数据编码的DNA文件中检索和分手，而不会粉碎微隔室，由于膜渗入性在室温下获得恢复（图1b）。热限制PCR利用卵白质组，即基在卵白质-聚合物共轭物的半透性微隔室。生物素化的DNA文件可以经由过程封装的生物素连系卵白Tamavidin 2-HOT不变地定位在卵白质组腔内。作者起首展现了在Tamavidin 2-HOT卵白质组内生物素标识表记标帜的DNA模板的热不变保存。接下来，作者利用共聚焦荧鲜明微镜阐发了卵白质组对单链DNA（ssDNA）和双链DNA（dsDNA）的温度依靠性渗入性，并发现膜渗入性在较高温度下显著下降。基在这个不雅察成果，作者肯定将个别反映隔离在卵白质组内，在两个模板的多路复合PCR扩增时代显著下降了份子干扰。然后，作者将这些成果扩大到25个DNA文件的同时扩增，总共跨越150万个怪异序列。作者展现了与年夜范围扩增比拟，当反映在卵白质组内隔离时，多路复合扩增这个复杂DNA池会致使更平均的序列表征。另外，作者证实卵白质组可以经由过程共封装磁珠实现屡次反复的读取操作，从而在PCR根本上实现随机拜候后高效地恢回复复兴始封装的DNA文件。最后，作者确认该平台与利用短DNA链和膜标签的荧光元数据标识表记标帜兼容。另外，作者展现告终合荧光分选，可以按照元数据有选择地检索和扩增DNA文件，这是比来用在类似性和Boolean文件搜刮的一种方式。

图1. 卵白质组作为DNA信息存储的平台

为了领会卵白质组的热性质若何影响封装的DNA文件的PCR，作者研究了卵白质组的温度依靠性不变性和渗入性。因为链霉亲和素仅在PCR时代利用的高温下部门耐受，是以作者利用热不变的链霉亲和素近似物Tamavidin 2-HOT44，它与链霉亲和素的亲和力类似，但可以耐受PCR时代更高的温度。作者制备了含有4 µM链霉亲和素或4 µM Tamavidin 2-HOT的卵白质组，以验证这两种卵白在此中的热不变性。然后，经由过程将双链DNA与卵白质组一路孵育，将生物素化的、标识表记标帜有Cy5的188 nt双链DNA A1F1定位在制备好的卵白质组内。共聚焦显微镜图象显示，在加热至95°C后，只有利用Tamavidin 2-HOT制备的卵白质组才能保存内部的双链DNA（图2a）。为了简化对卵白质组的下流检索，作者还在卵白质组内添加了超顺磁性颗粒。这两个改变配合发生了含有热不变定位DNA和磁性检索的卵白质组。当PNIPAm跨越其临界溶液温度（LCST）时，它变得部门不相容，是以作者揣度在LCST以上下降膜渗入性可以保存PCR处置进程中捕捉的DNA份子（图2b）。为了研究ssDNA的温度依靠的渗入性，作者起首验证了在室温下封装Tamavidin 2-HOT的卵白质组对ssDNA的渗入性。如预期的那样，ssDNA很轻易穿过膜。由于ssDNA F2没有生物素化，所以洗涤捕捉的卵白质组会敏捷掉去荧光，注解在室温下，卵白质组膜对ssDNA很是渗入（图2c）。接下来，作者制备了含有生物素化的21个核苷酸链A2和与之配对的Alexa-546标识表记标帜的50个核苷酸ssDNA F2的10个核苷酸的段的Tamavidin 2-HOT卵白质组，并将卵白质组加热至95°C，以确保DNA双链完全融化。在这个温度下的共聚焦成像尝试显示，局部荧光随时候迟缓削减（图2d）。这个成果注解相对较长的ssDNA在这个温度下的膜渗入性要低很多。在95 °C下利用长度为31个核苷酸的Alexa-546标识表记标帜的ssDNA，DNA敏捷渗入过膜。一旦冷却到LCST以下的温度，膜对长短ssDNA都再次高度渗入，注解温度引诱的膜渗入性转变是可逆的。综上所述，作者的成果显示，Tamavidin 2-HOT卵白质组可以在高温下不变定位生物素化的双链DNA，即便DNA双链融化，膜的高渗入性也能够在冷却到LCST以下的温度时恢复。

图2. 温度依靠性 DNA 定位（温度依靠性研究利用的是INTERHERENCE公司的超精 准可调理温度节制模块-VAHEAT）

在肯定生物素化的DNA在加热至PCR温度时仍定位在Tamavidin 2-HOT卵白质组内，具有单个生物素润色的长双链DNA的两个链即便双链DNA融化时仍定位在卵白质组内，膜渗入性可以经由过程温度节制后，作者进一步进行了卵白质组内定位DNA模板的酶促扩增。为了展现含有内部Tamavidin 2-HOT的卵白质组对DNA数据检索的通用合用性，作者接下来展现了定位的生物素化的DNA，其长度凡是用在数据存储，可使用PCR或SDA进行扩增（图3a）。为了在原位丈量PCR下的局部dsDNA扩增，作者利用了定量PCR（qPCR; 方式）。含有4µM Tamavidin 2-HOT的卵白质组被孵育在300 nM生物素化的178nt模板dsDNA T1A1或非生物素化的168nt对比dsDNA T1SU1。颠末洗涤以去除游离模板后，作者添加了PCR反映夹杂物，包罗聚合酶、脱氧核苷酸三磷酸（dNTPs）、引物和dsDNA敏感荧光染料EvaGreen。平均而言，当利用生物素化的dsDNA时，需要少4.4个轮回才能到达荧光阈值，而非生物素化的dsDNA需要更多的轮回（图3b）。假定在每一个PCR轮回中扩增完善，这注解与布景程度比拟，生物素化的dsDNA可供扩增的dsDNA约为21倍，证实Tamavidin 2-HOT定位的dsDNA可供PCR扩增利用。接下来，作者利用SDA来等温扩增定位的dsDNA。含有T1A1的卵白质组的SDA反映显示，平均扩增速度比孵育非生物素化的T1SU1的高8.6倍（图3c）。PCR和SDA的成果注解，Tamavidin 2-HOT定位的生物素化dsDNA，和凡是用在DNA数据存储的长度，可以从卵白质组内部扩增。

图3. 卵白质组内定位的DNA的酶促扩增

基在PCR的随机拜候可以从复杂的DNA池中检索编码数据。但是，包括高度类似的短区域的序列在PCR进程中轻易产生重组。这类嵌合体的发生粉碎了DNA文件，由于数据插入了毛病的位置。另外，嵌合体的构成会致使复杂DNA池中的PCR误差，之前采取乳化PCR来按捺此现象。作者认为，卵白质组的温度节制的膜通透性应当在复杂DNA池的热限制性多重PCR中削减嵌合体的构成，由于在典型的PCR温度下，模板被有用地隔离（图4a）。为了研究热限制性多重PCR从定位的模板中若何影响嵌合体的构成，作者设计了两组生物素化的178nt长的dsDNA模板（T1A1和T2A3），它们同享一个31nt的互补区域，如许在多重PCR中构成的嵌合体C1C2长度为71bp（图4b）。为了将两个模板定位在别离含有4µM Tamavidin 2-HOT的单个卵白质组中，作者采取了分歧的生物素化策略来合成它们。T1A1被生物素化在其5'端，而T2A3被生物素化在其3'端。作者起首对单个卵白质组进行了热限制性多重PCR，利用EvaGreen来检测扩增。作者发现，与不决位的模板比拟，定位的模板发生更少的嵌合体，这注解卵白质组的温度节制的膜通透性确切削减了嵌合体的构成（图4c）。作者还进行了夹杂DNA池的热限制性多重PCR，此中包括两个生物素化的模板和未标识表记标帜的dsDNA，以摹拟复杂DNA池。在利用定位的模板时，嵌合体的发生较着削减，这注解定位的模板在复杂DNA池中的热限制性多重PCR中依然表示出较低的嵌合体构成率（图4d）。

图4. 局部扩增可削减PCR进程中的份子串扰

因为生物素化的DNA依然局限在Tamavidin 2-HOT卵白质组内，作者估计在PCR后利用磁性分手来恢复卵白质组和其封装的DNA编码文件，可以靠得住地反复拜候DNA编码数据。为了测试这一点，作者将三个文件定位在含有4 µM Tamavidin 2-HOT的卵白质组内。在夹杂前，清洗了卵白质组以建立基在卵白质组的文库。另外，文件还以等摩尔浓度夹杂在批量中以生成非局限文库。从生成的文库中，文件在三个持续的批量、乳化或卵白质组PCR回合中扩增，每一个回合检索一个分歧的文件。颠末三轮后，作者再次拜候了初始文件。主要的是，在PCR反映之间，作者利用磁性分手恢复了卵白质组定位的文库，并反复利用该文库扩增下一个文件。利用批量PCR扩增的文库在利用之前经由过程灭活dNTP和引物进行纯化以用在扩增下一个文件。最后，经由过程破乳和自旋柱纯化对利用乳化PCR扩增的文库进行了纯化。利用Illumina测序，作者肯定了文件内的丢掉率（图5c）。作者不雅察到，反复拜候基在卵白质组的文库PCR发生了最低的序列丢掉率，其次是乳化PCR和批量PCR（图5d）。这些成果配合注解，基在卵白质组的DNA文件封装和随后的年夜范围DNA文库聚集，简化了靠得住的反复多路PCR操作。

图5. 多重PCR和卵白质组内DNA编码文件的反复拜候

PCR根本的DNA文件检索很是特异性；但是，需要足够正交引物的需求限制了可以存储在单个池中的文件数目。这类限制致使了弥补策略的开辟，以实现随机拜候DNA文件，例如物理分手、基在杂交的检索、另类扩增方案和基在荧光辅助的分选等。除反复多路PCR外，作者还试图设计方式，以选择性地从DNA编码的卵白质组文库中检索文件。为了实现这个方针，作者生成了一种基在荧光条形码卵白质组群体的策略，该策略基在利用FITC和DyLight 405标识表记标帜微囊膜，和在初始数据编码DNA文件定位在卵白质组内后添加短的生物素化的、Cy3（F4）标识表记标帜或Cy5（F5）标识表记标帜的单链DNA来进行条形码标识表记标帜（图6a）。在将编码数据的DNA封装在带有条形码的卵白质组中后，作者聚集了各自的群体，并利用荧光激活细胞分选（FACS）从池当选择特定的文件（图6b），经由过程三步选择法式。荧光数据中仅不雅察到单峰散布，从而注解各个群体平均。将池分手成单个群体后，作者利用qPCR来肯定每一个文件在分手群体中的比例，以确认准确检索到了编码的DNA数据（图6d）。作者发现，方针文件占排序样品中所有DNA的平均75.0％（每一个非方针文件平均为8.4％），从而证实了对其他文件的富集。这些成果注解，卵白质组不但与基在PCR的随机拜候兼容，并且基在荧光的卵白质组元数据检索也是可能的。对基在DNA的数据存储，DNA的持久不变性相当主要。先前的研究已注解，DNA的冻干可以将DNA的水解不变性提高约一个数目级。作者在海藻糖存鄙人对包括内部DNA的卵白质组进行了冻干。显微镜和qPCR尝试注解，在固体粉末从头消融后，DNA的完全性和共定位在卵白质组内没有遭到影响。主要的是，在从头消融后，作者没有不雅察到卵白质组的聚合。

图6. 荧光辅助分选卵白质组，用在选择性的文件检索

总结与会商

跟着DNA合成和测序手艺的前进，将数字数据持久存储在DNA上已成为可能。但是，迄今为止，频频和并行的基在PCR的随机拜候依然具有挑战性。本研究开辟了一种基在热响应性半透膜细小隔室的方式，实现了与乳化PCR相当的多重PCR随机拜候机能。但是，与乳化PCR分歧的是，在扩增和数据检索后，封装的DNA编码文件依然连结在细小隔室内，是以使得原始文件编码份子可以反复复制。另外，作者还插手了基在荧光的条形码，并将其用在基在细小隔室的文件排序，供给了额外的数据组织条理。在当前的DNA合成价钱下，利用细小隔室进行DNA文件定位不会致使每MB存储数据的价钱显著增添，而细小隔室定位的数据的物理密度与其他DNA封装方式相当。与乳化PCR比拟，基在细小隔室平台的DNA编码数据文件的初始定位相对耗时；但是，一旦定位，封装的文件是完全可拜候的，无需进行年夜量的处置步调，简化了数据检索。将来的研究将致力在利用加快老化实验研究干燥状况下封装的DNA的持久不变性。

VAHEAT超精 准可调理温度节制模块

本文中，微胶囊的温度限制渗入性研究利用的是超精 准可调理温度节制模块-VAHEAT，该模块在长时候(小时到天)和短时候(秒到分钟)下的温度不变性可至0.01°C(RMS)，加热速度可达100℃/s，温度可达200℃，不但为该尝试供给了快速和切确的温度节制，同时也包管了优胜的成像质量。

超精 准可调理温度节制模块-VAHEAT

VAHEAT首要特点

温度不变性高：0.01℃

温控规模广：RT-200℃

优胜的成像质量

快速且靠得住，用在油浸物镜

四种加热模式可按照用户需求进行分歧的尝试

VAHEAT典型案例

VAHEAT部门客户

VAHEAT部门颁发文献

1. An inkjet-printable fluorescent thermal sensor based on CdSe/ZnS quantum dots immobilised in a silicone matrix.Sensors and Actuators A, 2022.

2. Colloidal black gold with broadband absorption for photothermal conversion and plasmon-assisted crosslinking of thiolated diazonium compound.ChemRxiv, 2022.

3.Mechanistic Insights into the Phase Separation Behavior and Pathway-Directed Information Exchange in all-DNA Droplets.Angewandte Chemie, 2022.

4. Reversible speed control of one-stimulus-double-response, temperature-sensitive asymmetric hydrogel micromotors.Chemical Communications, 2022

5. Progress and Challenges in Archaeal Cell Biology. In: Ferreira-Cerca, S. (eds) Archaea.Methods in Molecular Biology, 2022.

6. Phase-separation antagonists potently inhibit transcription and broadly increase nucleosome density.Journal of Biological Chemistry, 2022

7. A DNA Segregation Module for Synthetic Cells.Small, 2022

8. Precision size and refractive index analysis of weakly scattering nanoparticles in polydispersions.Nature Methods, 2022

9. The Spo13/Meikin pathway confines the onset of gamete differentiation to meiosis II in yeast.EMBO Journal, 2022

10. Microscale Thermophoresis in Liquids Induced by Plasmonic Heating and Characterized by Phase and Fluorescence Microscopies.The Journal of Physical Chemistry C, 2022.

11. A synthetic tubular molecular transport system.Nature Communications, 2021.

12. Deprotection of centromeric cohesin at meiosis II requires APC/C activity but not kinetochore tension.EMBO Journal, 2021.

13. Are bacteria claustrophobic? The problem of micrometric spatial confinement for the culturing of microorganisms.RSC Advances, 2021.

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参考文献

1. Bögels, B.W.A., et al.,DNA storage in thermoresponsive microcapsules for repeated random multiplexed data access.Nature Nanotechnology, 2023.